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| 內容簡介： |
本书主要是作者近年来在鼠伤寒沙门菌胞外核酸酶活性与功能研究领域取得的相关成果。书中主要介绍了鼠伤寒沙门菌的理化特性和核酸酶的分类与功能，鼠伤寒沙门菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的鉴定，鼠伤寒沙门菌5‘一nucleotidase基因的原核表达及活性分析，鼠伤寒沙门菌5’一nucleotidase基因缺失菌株的构建与生物学特性，重组5-nucleotidase核酸酶活性对METs的作用和影响。來源：香港大書城megBookStore,http://www.megbook.com.hk
本书具有较好的学术价值，可为相关领域科研工作者、研究生、教师了解更多的鼠伤寒沙门菌与宿主互作的机制，为动物沙门菌病的防控研究提供一定的参考。
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| 目錄：
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第1章 绪论 1
1.1鼠伤寒沙门菌的理化特性
11.1.1沙门菌病原学 2
1.1.2沙门菌的流行病学 4
1.1.3沙门菌的诊断和鉴定 5
1.1.4沙门菌病的防治7
1.1.5鼠伤寒沙门菌的致病机制 9
1.1.6鼠伤寒沙门菌的危害 10
1.2核酸酶 11
1.2.1核酸酶的分类 11
1.2.2核酸酶的功能 12
1.2.3核酸酶在微生物感染中的作用 14
1.3微生物 5‘-nucleotidase16
1.4目的与意义 20
第2章 鼠伤寒沙门菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的鉴定 22
2.1材料 23
2.1.1菌株 23
2.1.2主要试剂和培养基 23
2.1.3主要试剂和培养基的配制 23
2.1.4主要仪器设备 25
2.2方法 25
2.2.1鼠伤寒沙门菌 SL1344株胞外蛋白的收集 25
2.2.2琼脂糖凝胶电泳法测定胞外蛋白的核酸酶活性 26
2.2.3琼脂扩散法测定胞外蛋白的核酸酶活性 26
2.2.4琼脂培养法测定胞外蛋白核酸酶活性 27
2.2.5温度对胞外蛋白核酸酶活性的影响 27
2.2.6pH对胞外蛋白核酸酶活性的影响 27
2.2.7金属阳离子对胞外蛋白核酸酶活性的影响 28
2.2.8胞外蛋白活性核酸酶的 SDS-PAGE酶谱和 LC-ESI/MS/MS分析 28
2.3结果 29
2.3.1琼脂糖凝胶电泳法测定胞外蛋白的核酸酶活性 29
2.3.2琼脂扩散法测定胞外蛋白的核酸酶活性 30
2.3.3琼脂培养法测定胞外蛋白的核酸酶活性 31
2.3.4温度对胞外蛋白核酸酶活性的影响 32
2.3.5pH对胞外蛋白核酸酶活性的影响 32
2.3.6金属离子对胞外蛋白核酸酶活性的影响 33
2.3.7胞外蛋白活性核酸酶的 SDS-PAGE酶谱和 LC-ESI/MS/MS分析 35
2.4讨论 37
2.5小结 40
第3章 鼠伤寒沙门菌 5′-nucleotidase 基因的原核表达及活性分析 41
3.1材料 42
3.1.1菌株和质粒 42
3.1.2主要试剂和培养基 42
3.1.3主要试剂和培养基的配制 43
3.1.4主要仪器设备 45
3.2方法 46
3.2.1引物合成 46
3.2.2PCR产物或酶切产物的回收与纯化 47
3.2.3大肠杆菌感受态的制备 47
3.2.4质粒的提取与鉴定 48
3.2.55’-nucleotidase目的基因的扩增 49
3.2.6pMD18-T-5‘-nucleotidase克隆载体的连接与转化 50
3.2.7pMD18-T-5’-nucleotidase克隆载体的鉴定 51
3.2.8生物信息学分析 51
3.2.9重组表达载体 pET-32a-5‘-nucleotidase的构建及鉴定 53
3.2.10重组 5’-nucleotidase蛋白的诱导表达 54
3.2.11重组 5‘-nucleotidase蛋白的纯化 54
3.2.12SDS-PAGE鉴定 55
3.2.13Western-Blot分析 .57
3.2.14不同温度对重组 5’-nucleotidase表达的影响 57
3.2.15IPTG浓度对重组 5‘-nucleotidase诱导表达的影响 58
3.2.16诱导时间对重组 5’-nucleotidase诱导表达的影响 58
3.2.17重组 5‘-nucleotidase的核酸酶活性检测 59
3.2.18不同浓度对重组 5’-nucleotidase的核酸酶活性的影响 60
3.2.19不同温度对重组 5‘-nucleotidase的核酸酶活性的影响 60
3.2.20重组 5’-nucleotidase的热稳定性检测 60
3.2.21pH对重组 5‘-nucleotidase的核酸酶活性的影响 61
3.2.22金属阳离子对重组 5’-nucleotidase核酸酶活性的影响 61
3.3结果 61
3.3.1pMD18-T-5‘-nucleotidase的鉴定 61
3.3.2同源性分析 633.3.3理化性质分析 63
3.3.4结构分析 65
3.3.5重组表达载体 pET-32a-5’-nucleotidase鉴定 67
3.3.6SDS-PAGE鉴定及 Western-blot分析 67
3.3.7不同温度对重组 5‘-nucleotidase表达的影响 68
3.3.8不同 IPTG浓度对重组 5’-nucleotidase表达的影响 69
3.3.9不同诱导时间对重组 5‘-nucleotidase诱导表达的影响 ..70
3.3.10重组 5’-nucleotidase的核酸酶活性检测 71
3.3.11不同浓度的重组蛋白对其核酸酶活性的影响 72
3.3.12温度对重组 5‘-nucleotidase核酸酶活性的影响 73
3.3.13重组 5’-nucleotidase热稳定性检测 74
3.3.14pH对重组 5‘-nucleotidase核酸酶活性的影响 74
3.3.15离子对重组 5’-nucleotidase核酸酶活性的影响 75
3.4讨论 76
3.5小结 81
第4章 鼠伤寒沙门菌 5′-nucleotidase基因缺失菌株的构建与生物学特性82
4.1材料 84
4.1.1菌株、质粒和细胞 84
4.1.2主要试剂和培养基 84
4.1.3主要试剂的配制 85
4.1.4主要仪器设备 .87
4.2方法 87
4.2.1引物的设计合成 87
4.2.25‘-nucleotidase基因上下臂片段的扩增 88
4.2.3中间载体 pSK-Δ5’-nucleotidase的构建 89
4.2.4重组自杀性质粒 pRE-Δ5‘-nucleotidase的构建 89
4.2.5缺失菌株 SL1344Δ5’-nucleotidase的筛选 90
4.2.6沙门菌感受态的制备 90
4.2.7沙门菌的电转化 91
4.2.8SL1344CΔ5‘-nucleotidase回复菌株的构建 92
4.2.9缺失菌株 SL1344Δ5’-nucleotidase的表型鉴定及生化特性 92
4.2.10缺失菌株 SL1344Δ5‘-nucleotidase的遗传稳定性 93
4.2.11缺失菌株 SL1344Δ5’-nucleotidase生长特性 93
4.2.125‘NT基因对鼠伤寒沙门菌运动性的影响 94
4.2.13缺失菌株 SL1344Δ5’-nucleotidase的耐酸碱和耐盐性检测 94
4.2.145‘NT基因对鼠伤寒沙门菌耐药性的影响 95
4.2.15缺失菌株 SL1344Δ5’-nucleotidase的生物被膜检测 95
4.2.16缺失菌株 SL1344Δ5‘-nucleotidase对 HeLa细胞的黏附和侵入试验 96
4.2.17缺失菌株 SL1344Δ5’-nucleotidase的毒力测定 97
4.2.18缺失菌株免疫小鼠后血清中 IgG含量的测定 98
4.2.19缺失菌株 SL1344Δ5‘-nucleotidase免疫保护率测定 99
4.2.20缺失菌株的胞外蛋白核酸酶活性检测 100
4.3结果 .100
4.3.15’-nucleotidase基因上下臂片段的扩增 100
4.3.2中间载体 pSK-Δ5‘-nucleotidase的鉴定 102
4.3.3自杀性质粒 pRE-Δ5’-nucleotidase的鉴定 103
4.3.4缺失菌株 SL1344Δ5‘-nucleotidase的筛选 104
4.3.5SL1344CΔ5’-nucleotidase回复菌株的鉴定 104
4.3.6缺失菌株 SL1344Δ5‘-nucleotidase的表型鉴定及生化特性 106
4.3.7缺失菌株 SL1344Δ5’-nucleotidase的遗传稳定性 106
4.3.8缺失菌株 SL1344Δ5‘-nucleotidase生长特性鉴定 107
4.3.95’NT基因对鼠伤寒沙门菌运动性的影响 108
4.3.10缺失菌株的耐酸碱性和耐盐性检测 108
4.3.115‘NT基因对鼠伤寒沙门菌耐药性的影响 109
4.3.12缺失菌株 SL1344Δ5’-nucleotidase的生物被膜检测 109
4.3.13缺失菌株对 HeLa细胞的黏附和侵入试验 110
4.3.14SL1344Δ5‘-nucleotidase缺失菌株毒力测定 111
4.3.15缺失菌株免疫小鼠后血清中 IgG含量的测定 112
4.3.16缺失菌株 SL1344Δ5’-nucleotidase免疫保护率测定 112
4.3.17缺失菌株的胞外蛋白核酸酶活性检测 113
4.4讨论 114
4.5小结 119
第5章 重组 5′-nucleotidase核酸酶活性对 METs的作用 120
5.1材料 121
5.1.1主要试剂 121
5.1.2主要仪器设备 121
5.1.3主要培养基及配制 122
5.2方法 123
5.2.1缺失菌株荧光显微镜观察 METs的形成 123
5.2.25‘NT基因对 METs杀伤鼠伤寒沙门菌的影响 123
5.2.3不同浓度 r5’NT对巨噬细胞活力影响 124
5.2.4不同孵育时间下 r5‘NT对巨噬细胞活力影响 124
5.2.5荧光显微镜观察 r5’NT对 METs的作用 125
5.2.6重组蛋白 r5‘NT对 METs杀伤鼠伤寒沙门菌缺失株的影响 125
5.3结果 126
5.3.1荧光显微镜观察 5’NT基因对鼠伤寒沙门菌诱导 METs形成的影响 .126
5.3.25‘NT基因对 METs杀伤鼠伤寒沙门菌的影响 127
5.3.3不同浓度重组蛋白 r5’NT对巨噬细胞活力影响 127
5.3.4不同处理时间下重组蛋白 r5‘NT对巨噬细胞活力影响 128
5.3.5荧光显微镜观察重组蛋白 r5’NT对 METs的作用 129
5.3.6重组蛋白 r5NT对 METs杀伤鼠伤寒沙门菌缺失株的影响 129
5.4讨论 131
5.5小结 133
第6章 结论 134
附录 中英文符号对照表 136
参考文献 138
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| 內容試閱：
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病原体分泌胞外蛋白是逃避宿主先天性免疫反应的重要机制。核酸酶广泛存在于微生物中 ，主要参与营养代谢、遗传物质的复制、重组和修复机制等过程。某些细菌分泌的胞外核酸酶有利于病原体感染 ，被认为是细菌的一类重要毒力因子。5‘-核苷酸酶 (5’-nucleotidase， 5NT)是一种特殊的磷酸水解酶。部分病原体通过
5‘NT合成脱氧腺苷和腺苷以抑制宿主免疫反应 ，同时 5’NT可直接降解胞外诱捕网的 DNA结构 ，有助于病原体逃避中性粒细胞的杀伤。虽然基因组分析显示鼠伤寒沙门菌具有 5‘NT基因 ，但关于鼠伤寒沙门菌胞外蛋白是否具有核酸酶活性和 5’NT基因的研究尚未见报道。因此 ，本文首先对鼠伤寒沙门菌胞外蛋白的核酸酶活性进行分析和鉴定 ，然后以 5‘NT作为目的基因 ，克隆鼠伤寒沙门菌 5’NT基因 ，对5‘NT进行生物信息学分析 ，随后构建 5’NT原核表达系统 ，并诱导表达纯化获得重组 5‘NT蛋白并检测其核酸酶活性。同时 ，采用同源重组技术构建鼠伤寒沙门菌 5’NT基因缺失菌株 ，并分析缺失菌株的生物学特性。最后 ，检测重组蛋白r5‘NT对巨噬细胞胞外诱捕网的作用为进一步探究 5’NT在鼠伤寒沙门菌感染中的作用奠定基础。
首先 ，开展鼠伤寒沙门菌胞外分泌蛋白核酸酶活性的鉴定研究。通过琼脂糖凝胶电泳法、琼脂扩散法和琼脂培养法证实了鼠伤寒沙门菌 SL1344株的胞外蛋白具有降解 λDNA的活性 ，且具有剂量依赖性 ，最适温度和 pH分别为 42℃和90。Na+、K+、Co2+、Cu2+、Fe3+和 Mn4+并不影响鼠伤寒沙门菌胞外蛋白的核酸酶活性。存在 Ba2+、Ca2+、Mg2+和 Ni2+的情况下 ，胞外蛋白的核酸酶活性具有明显的增强。SDS-PAGE酶谱分析发现鼠伤寒沙门菌胞外分泌蛋白存在四条活性核酸酶条带 ，采用 LC-ESI/MS/MS技术进一步鉴定出七种蛋白质。
其次 ，开展鼠伤寒沙门菌核酸酶基因 5‘NT的原核表达及活性分析的研究。通过 PCR扩增得到鼠伤寒沙门菌 5’NT基因 ，利用生物信息学相关软件对 5‘NT进行预测分析。将5’NT基因连接至表达载体 pET-32a构建重组表达质粒 pET-32a-5‘NT经大肠杆菌原核表达、纯化 ，采用 SDS-PAGE和 Western-blot分析 ，琼脂糖凝胶电泳分析重组蛋白的核酸酶活性。结果显示 ，成功克隆了 1482bp的5’NT基因 ，5‘NT与肠杆菌属有较高的同源性 ，异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷诱导获得可溶性和包涵体表达的重组 5’NT蛋白。通过对 r5‘NT可溶性表达的条件进行优化 ，发现异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷浓度为 05mmol/L、诱导温度为 20℃、诱导 6h时重组蛋白 r5’NT具有最高的可溶性表达。Western-blot结果表明重组蛋白 r5‘NT具有良好的反应原性。同时 ，通过琼脂糖凝胶电泳检测发现可溶性表达的重组蛋白 r5’NT可降解 λDNA，但核酸酶活性没有 DNaseⅠ强。随后探究不同浓度、不同反应温度、不同 pH和不同金属阳离子对 r5‘NT核酸酶活性的影响。结果发现 ， r5’NT核酸酶活性随着浓度的增加逐渐增强 ，在37℃、 pH6~7时重组蛋白核酸酶活性最佳 ;同时 Mg2+可以促进核酸酶活性而高浓度 Zn2+抑制核酸酶活性 ;另外 ， r5NT的热稳定性较差。
随后 ，开展鼠伤寒沙门菌核酸酶基因 5‘NT缺失菌株的构建研究。利用同源重组方法构建鼠伤寒沙门菌核酸酶基因 5’NT缺失菌株 ，以鼠伤寒沙门菌 SL1344株为受体菌、大肠杆菌 χ7213(pRE-Δ5‘NT)为供体菌 ，进行接合转移 ，并通过自杀性质粒介导的同源重组进行筛选 5’NT基因缺失菌株。PCR鉴定和测序结果显示 ，成功构建鼠伤寒沙门菌 5‘NT基因缺失菌株 SL1344Δ5’NT。将5‘NT基因连接至载体 pBR322，转化至 SL1344Δ5’NT缺失菌株构建回复菌株 SL1344CΔ5‘NT。对亲本菌株 SL1344、缺失菌株 SL1344Δ5’NT及回复菌株 SL1344CΔ5‘NT的表型、生长特性、遗传稳定性、生物被膜形成、对 HeLa细胞的黏附和侵入、对小鼠的毒力、免疫小鼠后IgG抗体水平以及对小鼠的免疫保护率、核酸酶活性等生物学特性进行检测。结果显示，缺失菌株 SL1344Δ5’NT的表型、生长特性、生物被膜以及侵袭能力等与亲本菌株基本相同，但是毒力明显降低，缺失菌株的 LD50增加至亲本菌株的51倍。缺失菌株免疫小鼠后血清中IgG抗体含量明显提高，且对小鼠有50%的免疫保护率。此外，缺失菌株SL1344Δ5NT的核酸酶活性较亲本菌株有所降低。
最后，开展重组蛋白r5‘NT对巨噬细胞胞外诱捕网作用的研究。将野生菌株 SL134、缺失菌株 SL134Δ5’NT和互补菌株 SL1344CΔ5‘NT与巨噬细胞共同孵育后发现缺失菌株诱导巨噬细胞释放更多的胞外诱捕网，而野生菌株和回复菌株处理组仅观察到极少量网状结构。通过检测胞外诱捕网对菌株的杀菌活性结果发现，METs对缺失菌株杀菌活性显著增高，而对野生菌株和回复菌株分别有30%和20%的杀菌活性。为进一步探究r5’NT对 METs的影响，采用 CCK-8法检测r5‘NT对巨噬细胞活力的影响。结果发现，r5’NT浓度为 200μg/mL孵育 05h后细胞活力可以达到 95%以上。在上述条件下将 r5‘NT加入反应体系进行孵育，结果显示，与缺失菌株处理组相比，加入r5’NT后 METs被降解且未观察到网状结构，同时，r5NT可以显著降低 METs对缺失菌株的杀菌能力。
衷心感谢张梦珂硕士和钱满硕士在完成本项目中辛勤付出。
感谢本实验室程相朝教授、张春杰教授、李银聚教授和吴庭才教授以及余祖华老师、贾艳艳老师、郁川老师、何雷老师和李静老师在本工作完成过程中的指导和帮助。
本书的出版得到了河南省自然科学基金项目 (2423042107)、国家自然科学基金项目 (32373015)和河南省高等学校青年骨干教师培养计划 (2023GGJS049)的资助。
廖成水
2025年6月
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