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| 編輯推薦： |
本书具有以下特点：
①每一个实验方案都融汇了编者的科研经验，实验方案与科研工作紧密接轨，可供科学研究参考；
②简洁实用，编者十分注重实验方案的易用性，强调实验方案的可操作性、流畅性和实验的成功率；
③从科研的角度设计实验方案，注重实验方案的系统性、综合性、逻辑性，注重培养学
生的科研素养和创新能力；
④实验方案注重多学科交叉，将基因工程、微生物学、生物化学与分子生物学、发酵工程、生物信息学、药学等学科进行交叉融合。书中的实验方案经过编者多年的实验教学及科研试用已经比较成熟，适用于药学、生物医药、生物医学、生物技术、生物工程、病原生物学、微生物药物学、生物化学与分子生物学等多个学科的实验教学及人才培养。
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| 內容簡介： |
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为提高大学生科研素养，山东第一医科大学、山东农业大学等 6 所高校的科研、教学人员编写了这部科研与教学多维度融合的实验教材。全书共三篇 15 章。上篇聚焦于细菌耐药性，以简明的文字、清晰的实验思路阐述了抗生素抗性基因的水平转移鉴定与分析、耐药细菌的基因组比对和分析、抗性基因的异源表达与功能分析、耐药细菌的抑制药物筛选及抗性蛋白的药物靶点分子模拟。中篇聚焦于微生物药物，先设计了如何筛选与鉴定微生物药物产生菌，然后介绍了通过何种策略来进行微生物药物克拉维酸、纳他霉素、安丝菌素及多黏菌素的发酵与检测。下篇聚焦于生物技术，介绍了如何应用大肠杆菌及天蓝色链霉菌的遗传操作体系来研究目的蛋白，以及如何通过分子生物学、基因工程技术、生物化学、酶学等技术分析目标产物。本教材内容全面，阐述系统，且注重多学科交叉应用，可作为生物医药、生物医学、微生物药物学、生物化学与分子生物学、生物技术、生物工程、病原生物学等学科实验教学用书。
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| 關於作者： |
付加芳，山东第一医科大学副教授，硕士研究生导师。山东省生物化学与分子生物学会理事会监事会监事、干细胞与精准医学分会委员。主持国家自然科学基金青年基金项目1项，山东省自然科学基金项目3项，山东省中医药科技项目1项，校（院）青年科学基金项目1项，山东省优质专业学位教学案例库建设项目1项。申领国家发明专利6项。
曹广祥，教授，博士研究生导师，山东第一医科大学医药生物技术教研室主任。山东省生物化学与分子生物学会干细胞与精准医学分会委员，山东省医药生物技术学会教育分会委员，《中国抗生素杂志》编委。主持国家自然科学基金面上项目1项，中国博士后科学基金1项，山东省重点研发项目2项，山东省自然科学基金面上项目1项。获国家科技进步二等奖1项，山东省科技进步二等奖1项，山东高等学校优秀科研成果奖三等奖1项。申领国家发明专利10余项。
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| 目錄：
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目? 录
上篇? 细菌耐药性篇
第 1 章 抗生素抗性基因的水平转移鉴定与分析 002
第 2 章 耐药细菌的基因组比对和分析 020
第 3 章 抗性基因的异源表达与功能分析 032
第 4 章 耐药细菌的抑制药筛选 047
第 5 章 抗性蛋白的药物靶点分子模拟 065
中篇? 微生物药物篇
第 6 章 微生物药物产生菌的筛选与鉴定 080
第 7 章 微生物药物克拉维酸的发酵与检测 095
第 8 章 微生物药物纳他霉素的发酵与检测 104
第 9 章 抗肿瘤药物安丝菌素的发酵与检测 119
第 10 章 微生物源药物多黏菌素的发酵与检测 127
下篇? 生物技术篇
第 11 章 重组人干扰素的异源表达及检测 138
第 12 章 单克隆抗体药物细胞株的构建与制备 150
第 13 章 L 丙氨酸生产菌的构建与产物检测 161
第 14 章 淀粉酶的提取与酶学性质分析 182
第 15 章 天蓝色链霉菌中骨架蛋白 Fts Z 的 eGFP 标记与定位 201
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| 內容試閱：
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第 1 章? 抗生素抗性基因的水平转移鉴定与分析
一、实验简介
多重抗生素耐药（multiantibiotic resistant，MAR）细菌的流行率正在迅速增加。这些 MAR 细菌及其抗生素抗性基因已成为全球公共卫生系统的威胁，严重危害人类健康。目前研究表明，由多重抗生素耐药菌基因组中的整合性接合元件（integrative and conjugative element，ICE）介导的抗生素抗性基因的水平转移是最普遍的抗性基因水平转移方式。
本部分先通过生物信息学软件及相关数据库分析，鉴定抗生素多重耐药菌基因组中的抗生素 ICE，并通过接合转移实验、最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）测定、PCR 实验检测抗生素 ICE 在两个不同菌株中的水平转移。通过基因组岛（genomic island，GEI）和 ICE 的分析，训练学生运用生物信息软件的技能，培养学生分析、归纳、演绎的能力；同时通过嗜麦芽寡养单胞菌 MER1 菌株中抗生素抗性 ICE 的鉴定，能举一反三，进而学会分析并鉴定出任何一个耐药菌基因组中的 ICE；通过检测介导的抗生素抗性基因在嗜麦芽寡养单胞菌 MER1 菌株和大肠杆菌 25DN 菌株中的水平转移实验训练，培养学生的独立实验、观察问题、分析问题和解决问题的能力，提高学生科研素养。实验参考流程见图 11。
二、MER1 菌株的抗生素 MIC 检测
（一）目的要求
1. 学习利用微量液体稀释法测定抗生素 MIC 的方法。
2. 掌握 MIC 测定技术的常规操作和注意事项。
3. 准确测定抗生素对 MER1 菌株的 MIC 值。
（二）实验原理
抗生素 MIC 是测量抗菌药物抗菌活性大小的一个指标，指在体外过夜培养后，能抑制病原菌生长的最低药物浓度。微量液体稀释法是测定抗生素 MIC 值的一种重要方法，该方法用 LB（luriabertani）液体培养基将抗生素做不同浓度的稀释，然后接入待检菌，定量测定抗生素对被测菌的 MIC 值。
多重耐药菌是指对 3 类或 3 类以上抗生素同时耐药的细菌。本实验通过微量液体稀释法测定 MER1 菌株对 8 种不同种类抗生素的 MIC 值，分析 MER1 菌株是否为多重耐药菌。
（三）仪器与材料
1. 实验器材
高压蒸汽灭菌锅、分光光度计（或酶标仪）、试管、接种环、移液器、96 孔板、培养箱、三角烧瓶、内径 90mm 平皿等常用玻璃器皿。
2. 材料与试剂
头孢克肟、美罗培南、多黏菌素、卡那霉素、氟苯尼考、红霉素、环丙沙星、四环素、酵母提取物、胰蛋白胨、氯化钠、琼脂粉。
3. 试验菌株
嗜麦芽寡养单胞菌 MER1、大肠杆菌 ATCC25922。
（四）操作步骤
1. 抗生素母液的制备
抗生素母液浓度及其溶剂见下表 11。表中所用试剂均需 0.22μm 无菌滤膜过滤除菌（过滤膜应区分有机系和水系）。配制好的抗生素母液储存于 20℃ 冰箱。
2. 培养基的制备
LB 液体培养基：酵母提取物（yeast extract）0.5%，胰蛋白胨（tryptone）1%，氯化钠 1%，121℃高压蒸汽灭菌 25min。
LA 固体培养基：酵母提取物 0.5%，胰蛋白胨 1%，氯化钠 1%，琼脂粉 2%，121℃高压蒸汽灭菌 25min。
3. 嗜麦芽寡养单胞菌 MER1 菌株的培养
(1) MER1 菌株的活化：将 MER1 菌株从 80℃冰箱取出，划线接种于 LA 固体培养基平板上（无菌操作），28℃活化过夜培养 12～16h。
(2) MER1 菌株的二次活化：挑取单个菌落接种到 2ml 的 LB 液体培养基中（无菌操作），28℃，每分钟 200 转，培养 4～6h。
(3) MER1 菌株的三次活化：将二次活化 MER1 菌株接种到 10ml 的 LB 液体培养基中（无菌操作），28℃，每分钟 200 转，培养至 OD 值为 0.6～0.8。
4. MER1 菌株的抗生素 MIC 测定
(1) MER1 菌悬液的制备：用 0.85% 灭菌生理盐水将活化的处于对数生长期的 MER1 菌株稀释 100 倍（无菌操作），稀释后每毫升菌液中含菌（1～2）× 106 CFU/ml。
(2) 稀释抗生素：无菌操作条件下将抗生素母液浓度稀释至 512μg/ml，备用。
(3) 加 LB 液体培养基：取无菌 96 孔板，在生物安全柜中向 96 孔板的每一个孔里都加入 100μl 的 LB 液体培养基。
(4) 二倍法稀释抗生素：在生物安全柜中向 96 孔板的第一排第一孔中加入100μl 稀释好的抗生素 A（浓度为 512μg/ml），充分混匀，吸取 100μl 加入第二孔，以此类推，从第二孔吸取 100μl 加入第三孔，直至第八孔，吸取最后一孔中的100μl 弃去。此时，每孔抗生素 A 的浓度从左至右依次为 256μg/ml、128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml。
(5) 加 MER1 菌液：无菌操作，向每孔中分别加入 100μl 稀释好的 MER1 菌液，此时药物终浓度从左至右分别是 128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml。
(6) 设置阳性、阴性对照：在同一个 96 孔板的 G 排做一排阴性对照（仅加入抗生素和 LB 液体培养基，不加 MER1 菌液），在 H 排做一排阳性对照（仅加入 LB 液体培养基和 MER1 菌液，不加抗生素）。
(7) 过夜培养：将 96 孔板放入 28℃摇床，过夜培养 16～20h。
(8) 结果判断：测定 OD600 处的吸光度。与阳性对照相比，完全抑制细菌生长的最低抗生素浓度作为该抗生素的 MIC 值。
注：以大肠杆菌 ATCC25922 标准菌株作为质控菌株，药敏判断标准参照CLSI 指南（CLSI，2017）。
（五）注意事项
1. 每次实验时采用大肠杆菌 ATCC25922 标准菌株在相同实验条件下进行测定。
2. 二倍稀释法稀释抗生素时，要注意混匀和更换枪头。
3. 用移液器吸取药液时，不能有气泡，枪头要伸进液体里面，而且要慢。
4. 测定 OD600 处的吸光度时，要注意混匀后再测定。
（六）问题分析与思考
1. 如何进行抗生素的二倍稀释？
2. 如何判定一株细菌为多重耐药菌？
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